2021年，諾貝爾化學獎授予了Benjamin List和David W.C.MacMillan，以表彰他們在“不對稱有機催化”的發(fā)展的貢獻。

什么是“不對稱有機催化”？為什么這個發(fā)現(xiàn)如此重要？那我們不得不提歷史上一個非常有名的事件——“反應停事件”。

“反應停事件”也稱“沙利度胺事件”，有一個藥劑師在合成抗生素藥物時分離到一個副產(chǎn)物沙利度胺，意外發(fā)現(xiàn)沙利度胺不但有鎮(zhèn)靜催眠作用，還能顯著抑制孕婦的妊娠嘔吐反應。后來，沙利度胺以商品名“反應?！闭酵葡蚴袌?，一時間風靡歐、非、拉美、澳洲和亞洲(主要在日本和中國臺灣地區(qū))。藥品生產(chǎn)廠家宣稱沙利度胺是“沒有任何副作用的抗妊娠反應藥物”，反應停事件成為“孕婦的理想之選” (當時的廣告語)。

后來統(tǒng)計，在“反應停事件”大行其道的短短4年里，造成近2萬名海豹肢畸形兒出生，其中4000名左右的嬰兒都是不到1歲就夭折了。

圖1. 反應停事件受害者（下圖為著名的勵志演說家尼克·胡哲）

后來的研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺實際上是由兩種非常相似的化學物組成，相似的就像我們的左右手一樣，難以區(qū)別，俗稱手性化合物。其右手化合物（R-構(gòu)型）具有抑制妊娠反應活性，而左手化合物（S-構(gòu)型）有致畸性，罪魁禍首就是它！而在當時，一方面，科學界尚不知道長得非常相似的兩個化合物在生物體內(nèi)有這么大的差異；另一方面，即使知道它們的差異，由于檢測手段的落后，也無法分辨哪個是左手化合物，哪個是右手化合物。

圖2. 沙利度胺有兩種構(gòu)型，呈鏡像結(jié)構(gòu)，但不能重疊

我們現(xiàn)在知道很多天然活性物質(zhì)都是帶有旋光性的，天然的Vc是左旋的，天然麥角硫因是左旋的，天然的組成蛋白質(zhì)的氨基酸基本都是左旋的，生物體內(nèi)的葡萄糖是右旋的等等，所以生命對于物質(zhì)的構(gòu)型是有嚴格的選擇的。

說一個我們都知道的，反式脂肪酸，只是雙鍵兩邊結(jié)構(gòu)有稍微的區(qū)別，反式脂肪酸就會對人體造成肥胖、心血管疾病、影響發(fā)育等各種壞處，但順式的十八碳烯酸（油酸）卻是人體必須脂肪酸。反式脂肪酸更穩(wěn)定，一般在高溫下，順式會轉(zhuǎn)變成更穩(wěn)定的反式結(jié)構(gòu)，所以經(jīng)過反復煎炸的油反式脂肪酸含量會提高。另外反式脂肪酸最大的來源是氫化植物油，主要是因為加氫在高溫高壓下進行，以前的技術(shù)又很難加氫完全（消除所有的雙鍵），殘留的雙鍵順式結(jié)構(gòu)會轉(zhuǎn)變?yōu)榉词浇Y(jié)構(gòu)。但現(xiàn)在技術(shù)已經(jīng)非常成熟，可以做到完全加氫，所以氫化植物油也可以做到0反式脂肪酸。（國家法律規(guī)定，當反式脂肪酸含量低于0.3%時可以標注0反式脂肪酸，因為正常的動植物油脂也含有一定量的反式脂肪酸）

圖3. 反式十八碳烯酸（上）和順式十八碳烯酸（下）

科學家要做的就是找到對我們有利的構(gòu)型并且定向合成它，因此這是一個偉大的工作。

回到我們的主題，α-GG（具有活性的甘油葡糖苷）又是如何合成的呢？

甘油有3個羥基（-OH），葡萄糖有五個羥基（-OH），天然構(gòu)型的葡萄糖是右旋的，標記為D型，它有兩種構(gòu)型，分別稱為α-D-（+）-吡喃葡萄糖和β-D-（+）-吡喃葡萄糖（見圖4）。理論上的甘油和葡萄糖的連接有30種構(gòu)型，自然存在的構(gòu)型有六種（見圖5），研究最多的是α構(gòu)型，那如何獲取這種構(gòu)型呢？目前一共有三種方法：化學法、發(fā)酵法和生物酶法。

圖4. 天然葡萄糖的構(gòu)型

圖5. 天然構(gòu)型的甘油葡糖苷

l 化學法

Tatsuuma-Honke 釀酒公司報道了通過化學法合成αGG、2S-1-αGG 和2R-1-αGG 的技術(shù)，它們都是米酒中甘油葡萄糖苷的活性成分。利用高碘酸鈉和硼氫化鈉催化麥芽糖醇為αGG，產(chǎn)率18％ 。之后又利用乙酸、四乙酸鉛和硼氫化鈉催化異麥芽糖得到的2S-1-αGG，產(chǎn)率為12％ 。然后以海藻糖為原料，用四醋酸鉛經(jīng)乙二醇裂解合成了2S-1-αGG 和2R-1-αGG 混合物（含量比為73 ：27），但它們的產(chǎn)率僅為5％ 。

所以，化學法合成得到的α-GG 轉(zhuǎn)化率太低、副產(chǎn)物多，因此后續(xù)純化步驟將是非常復雜且不經(jīng)濟的。但市場上可能依然存在一些化學合成的甘油葡糖苷，不經(jīng)過后續(xù)的分離提純，所以雜質(zhì)比較多，活性成分比較少，但價格便宜。

l 發(fā)酵法

發(fā)酵法目前是研究比較多的，在上一篇文章中我們提過，甘油葡糖苷是一些藍藻在高鹽壓力下合成的一種保護自己滲透壓和酶活性的相容性溶質(zhì)。那我們從這些菌里把甘油葡糖苷提取出來不就好了，而且可以保證100%的生物活性，但這個想法太簡單了。首先甘油葡糖苷雖然是細菌或者藍藻分泌的保護自己的成分，但并不會分泌到胞外，我們知道現(xiàn)在非常火的二裂酵母溶胞產(chǎn)物，里面的成分十分復雜，也沒有定量的標準。如果需要打碎細胞，然后從中提取甘油葡糖苷將是一個非常困難的過程。另外從1980年以來，大約有幾十種藍藻被篩選出來，是可以合成甘油葡糖苷的（見圖6一般中等耐鹽藍藻更喜歡積累甘油葡糖苷，低耐鹽菌更喜歡積累蔗糖或者海藻糖），所以篩選菌株才是首要的工作。

圖6 已知基因組序列的 67 株藍藻菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（neighbour joining algorithm NJ算法）。這棵樹被分成了一大群α-藍藻和β-藍藻。顏色條表示是否在基因組序列中發(fā)現(xiàn)了兼容溶質(zhì)生物合成的基因（Suc –蔗糖；Tre–海藻糖；GG –甘油葡糖苷；GGA –葡萄糖基甘油酸酯；GB –甘氨酸甜菜堿）。虛線條表示該途徑只是不完整的。

目前通過基因工程手段改造藍藻集胞藻Synechocystissp. PCC6803，提高了藍藻細胞中αGG 的合成效率并實現(xiàn)了αGG 產(chǎn)物向胞外的部分分泌。PCC6803也是文獻中研究最多的菌種。

發(fā)酵法制取活性物最優(yōu)勢的地方在于獲得的成分都是具有生物活性的，一般不用考慮構(gòu)型的問題。例如Vc、谷胱甘肽、麥角硫因等大多都是通過發(fā)酵法制取的。另外對于合成復雜的活性物或者高分子成分，發(fā)酵也是常用的方法，比如依克多因、壬二酸、β-葡聚糖等。但發(fā)酵法最大的壁壘在于菌株的篩選，以及后續(xù)的分離提純。所以發(fā)酵法獲得的產(chǎn)品價格是最高的。

l 生物酶法

生物酶法合成即將生物體內(nèi)的酶提取出來，在體外催化化學合成。由于酶大多數(shù)是蛋白質(zhì)，催化效率極高，而催化溫度很低，具有特定的構(gòu)象選擇性，是非常具有潛力的一種合成法。比如我們現(xiàn)在看到市場上有大量的代可可脂巧克力，一般會用到氫化植物油，然后通過酯交換得到和可可脂比較相似的脂肪酸組成，但傳統(tǒng)化學法比如酯交換反應一般通過堿催化，180-220℃反應，長時間反應容易生成反式脂肪酸，如果采用酶法合成，在較低的溫度（50-60℃）下就能獲得不含反式脂肪酸的產(chǎn)品。市場上還有很多0反式脂肪酸的植物奶油、植脂末，嬰幼兒奶粉中的代母乳脂，都可以通過酶法來合成。

甘油葡糖苷的酶法合成首先會選擇和生物體內(nèi)一致的過程（見圖7），但實際中使用較多的是蔗糖磷酸化酶（LmSPase），這是一種特異性的轉(zhuǎn)糖苷酶，有比較廣泛的應用。蔗糖磷酸酶在沒有磷酸鹽存在的條件下，可以催化甘油和蔗糖反應直接生成α-GG，所以路徑短了許多，產(chǎn)率也更高。表1是甘油葡糖苷的幾種合成方法，采用蔗糖磷酸化酶的產(chǎn)率大約為90%，速率達到12.7mg?L-1?h-1，雖然采用 甘油葡萄糖苷磷酸化酶（BsGGP）的速率更快，但它的底物是1-磷酸-葡萄糖（G-1-P），這個原料也需要蔗糖磷酸酶來催化，另外最后的產(chǎn)物引入了磷酸鹽，在除雜上又會多一個步驟。

圖7：甘油葡糖苷的模擬生物體內(nèi)的酶法合成過程

• 表1. α-GG的合成方法比較

綜上，可看出酶法才是α-GG最經(jīng)濟的合成方法，原料便宜，催化效率高，副產(chǎn)物少，后期分離提純更容易。

當然酶的催化向來是雙向的，既能合成也會水解，最終達到一個平衡。在反應中，溶劑的選擇非常重要，也是具有很大難度的技術(shù)。

我司代理萱嘉的高純度甘油葡糖苷，采用離子液體作為酶催化反應的溶劑，提高了反應的選擇性，更好的維持酶的活性。并且采用固定化酶，可以反復使用（酶的成本占反應的主要部分），得以降低成本。最終蔗糖的轉(zhuǎn)化率＞92%，反應液中2-α-GG濃度＞10%，該工藝極具優(yōu)勢，見圖8.圖9.

圖8. 離子液體作為酶催化反應溶劑的優(yōu)勢

圖9. 萱嘉甘油葡糖苷的合成示意圖

現(xiàn)在九九八十一難之間還差著一難，那就是——純化。純化是最終產(chǎn)品品質(zhì)的決定性因素，即使合成的產(chǎn)率不高，雜質(zhì)也很多，但純化做得好，依然可以得到高含量的目標產(chǎn)物，只是成本上的區(qū)別而已。不過前面的產(chǎn)物越復雜，后期的純化步驟也會越復雜。一般分離的步驟會先通過活性炭吸附色素和氣味成分，然后通過膜過濾和各種色譜柱層層分離，最后再蒸除水分以得到目標濃度的產(chǎn)品。由于萱嘉合成產(chǎn)率高，副產(chǎn)物少，經(jīng)過純化，是市場上少有的可以完全脫除甘油的產(chǎn)品，也是同品質(zhì)產(chǎn)品中，最具技術(shù)和成本優(yōu)勢。

至此，甘油葡糖苷的已經(jīng)連載完，可能后面還會有更多新的發(fā)現(xiàn)，愿與大家分享，如果有不對的地方，是個人能力所限，愿與大家多多交流，共同進步。

注：甘油葡糖苷的INCI名也可以叫密羅木提取物，但密羅木長于非洲沙漠，生長緩慢，數(shù)量也不多，大多數(shù)甘油葡糖苷為人工合成而非植物提取，另植物中存在βGG構(gòu)型，是藍藻和酵母中不存在的。

參考文獻

徐愷, 李麗, 付銘洋,等. 甘油葡萄糖苷αGG的制備方法及其研究進展[J]. 工業(yè)微生物, 2020(4).

Goedl C , Sawangwan T , Mueller M , et al. A High‐Yielding Biocatalytic Process for the Production of 2‐O‐(α‐D‐glucopyranosyl)‐sn‐glycerol, a Natural Osmolyte and Useful Moisturizing Ingredient[J]. Angewandte Chemie, 2010, 47(52):10086-10089.

Tan X , Luo Q , Lu X . Biosynthesis, biotechnological production, and applications of glucosylglycerols[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2016, 100(14):6131-6139.